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谷胱甘肽（GSH）几乎存在于所有人体细胞中，在控制细胞氧化还原状态中起着至关重要的作用［1–5］。GSH浓度异常与许多疾病密切相关，如艾滋病、癌症、肝损伤和衰老引起的疾病［2］。因此其检测方法层出不穷，如电致发光［6］、电化学法［7］、高效液相色谱（HPLC）［8］、毛细管电泳［9］、质谱（MS）［10］、表面增强拉曼散射（SERS）［11］、荧光法［12］等，这些方法因为复杂的操作程序，对专业检测人员要求较高，而且操作过程耗时、仪器昂贵、灵敏度不高、专一性差。比色法相较于其他方法，由于其快速、成本低和可见性好等优点引起了广泛关注。
模拟酶3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）和O2体系是比色检测GSH最常用的方法之一。在包括碳基纳米材料［13–15］、无机纳米颗粒［16–17］和金属有机骨架基纳米材料［18–19］等模拟酶的催化下，TMB被O2氧化后，溶液颜色从无色变为蓝色。加入GSH后，蓝色逐渐褪去。基于此，本文制备了一种核壳纳米结构的Au@MnO2复合材料，这种Au@MnO2复合材料在氧气存在下，无需添加额外的氧化剂即可显示出较强的催化活性，将TMB氧化成TMB的氧化产物（oxTMB），从而使其溶液的颜色从无色变为蓝色；加入GSH后，TMB的氧化产物（oxTMB）和GSH反应又重新生成了TMB，最终导致溶液蓝色褪去，并伴随着溶液的吸光度变化，因此可以利用该变化比色检测GSH的含量，其检测原理如图1所示。
实验使用试剂有：氯金酸、柠檬酸钠、高锰酸钾（KMnO4）和聚烯丙胺盐酸盐（PAH）购于美国Sigma Aldrich公司。3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）、抗坏血酸（AA）、半胱氨酸（Cys）、茶多酚（TP）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）、柠檬酸（CA）、葡萄糖（Glu）、褪黑素（Mel）和谷胱甘肽（GSH）购于上海阿拉丁公司。所有试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。
测试仪器有：UV-vis 2700型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）、H-7560型透射电子显微镜（TEM，日本日立公司）、JSM-7800型扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）和实验级超纯水器（Aquaplore 3S，美国艾科浦公司）。
在剧烈搅拌下将0.74 ml 0.1 mol·L−1 HAuCl4溶液加入295 ml沸腾超纯水中。然后，加入4.5 ml 10 mg·ml−1柠檬酸钠，并加热约15 min，所得溶液冷却至室温并在4 ℃储存。向所得纳米金溶液中添加1.5 ml 22 mg·ml−1 KMnO4溶液。反应5 min后，将3 ml 25 mg·ml−1的PAH滴入溶液中搅拌1 h，直到溶液颜色从紫色变为深绿色。然后将Au@MnO2在10000 r·min−1下离心20 min并用纯水洗涤3次后获得Au@MnO2，净化后的Au@MnO2分散在去离子水中以备将来使用［20］。
图2为Au@MnO2纳米粒子的SEM图像、TEM图像和线性扫描图。可见，所制备的Au@MnO2纳米粒子具有类似于飞碟状的纳米结构，其中，纳米核是平均尺寸约为50 nm的金纳米粒子，壳是厚度为20~30 nm的MnO2，产生了均匀的核壳结构（2（b））。图2（c）的线性扫描图表明Au@MnO2纳米粒子由Au，Mn和O元素组成。
通过UV-vis研究了Au，MnO2和Au@MnO2的氧化物酶催化活性，如图3所示。可见，MnO2和Au@MnO2在O2存在下催化TMB的氧化，在650 nm处有一个明显的UV-vis吸收峰，溶液颜色为蓝色。与MnO2-TMB-O2体系相比，Au@MnO2-TMB-O2体系表现出更强的吸收峰和更蓝的溶液颜色，表明Au@MnO2比MnO2具有更好的氧化物酶性能。对于Au-TMB-O2系统，其在650 nm处的吸收峰几乎可以忽略不计。
图4为含有不同浓度GSH的oxTMB溶液的UV-vis吸收光谱，溶液吸光度和谷胱甘肽浓度与GSH浓度对数之间的关系以及相应溶液颜色照片。可见，在最优条件（pH为6，MnO2和TMB的反应时间为10 min，GSH的孵化时间为5 min）下，随着GSH浓度从0到5 μmol·L−1的增加，oxTMB在650 nm波长处的吸光度逐渐降低（图4（a，b）），伴随着颜色从深蓝色变为浅蓝色（图4（d））。同时，由图4（c）可知，吸光度变化（ΔA650 nm）与GSH浓度（1 nmol·L−1~50 μmol·L−1）的对数成正比（R=0.991），其中ΔA是不含GSH和含GSH溶液吸光度的差值。基于信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=3［21］，检测限（LOD）达到0.79 nmol·L−1，远低于血清中GSH的最低水平（0.5~10 mmol·L−1）［22］。与表1中的其他GSH检测方法相比，该方法对GSH检测更敏感，LOD更低。
| Methods | Linear range/（μmol·L−1） | Detection limit/（μmol·L−1） | Refs. |
|---|---|---|---|
| Colorimetry | 1 nmol·L−1~50 μmol·L−1 | 0.79 nmol·L−1 | This work |
| Colorimetry | 0~20 | 0.68 | ［23］ |
| Colorimetry | 1~100 | 0.45 | ［24］ |
| Colorimetry | 0.1~20 | 0.058 | ［25］ |
| Fluorescence | 0.5~250 | 160 nmol·L−1 | ［26］ |
| Fluorescence | 0~300 | 0.28 | ［27］ |
| Fluorescence | 0.01~3 | 2.7 nmol·L−1 | ［28］ |
为了考察该传感器对GSH的选择性，采用AA，Cys，TP，DA，UA，CA，Glu和Mel作为干扰物，结果如图5所示（GSH浓度：0.5 μmol·L−1，干扰抗氧化剂浓度：50 μmol·L−1）。可见，这些浓度是GSH浓度100倍的干扰物质对oxTMB吸光度的影响非常小。与空白溶液吸光度相比，这些干扰物引起的吸光度差值在0.012~0.05之间。然而，与空白相比，0.5 μmol·L−1 GSH引起吸光度发生巨大变化，吸光度差值为0.362。以上结果表明，AA，Cys，TP，DA，UA，CA，Glu和Mel对GSH检测几乎没有影响，并且GSH的检测选择性是可以接受的。
为了评估该方法在复杂真实样品中的可行性，对人血清中的GSH进行了测定。人体血液中GSH的正常含量为26~34 mg·（100 g）−1。为了研究这种传感器对血清样品中GSH的定量检测能力，首先将血清通过硝酸纤维素膜（0.22 μm）过滤以去除杂质，然后将血清稀释100倍，在稀释后的血清样品中加入一定含量的GSH，使血清中GSH的最终浓度在5 nmol·L−1~50 μmol·L−1之间，如图6（a）所示。与缓冲液中GSH的检测结果相比，血清中GSH（0~1 μmol·L−1）的低浓度几乎没有引起吸光率的变化；当GSH浓度超过1 μmol·L−1，出现更高的吸光率差（˂0.223）（图6（b）），这意味着受血清影响的高浓度GSH检测更为严重。然而，鉴于在5 nmol·L−1~1 μmol·L−1和1~50 μmol·L−1范围内，吸光度变化与GSH浓度之间具有良好的线性关系，如图6（c）所示，该传感器适用于实际样品中GSH的定量分析。此外，还使用GSH片剂进行回收试验。如表2所示，GSH片剂（0.1 g）样品的平均回收率为99.76%~102.1%。另外，也将本文的方法和医院常用的紫外酶法检测GSH做了对比。如表3所示，该方法与紫外酶在测定血清中的GSH水平方面具有可比性，表明该方法对实际样品中GSH的检测是可靠的。
| Samples | GSH concentration | Ultraviolet enzyme method | This method |
|---|---|---|---|
| 1 | 10.22 | 11.41±0.02a | 10.84±0.06 |
| 2 | 20.65 | 21.37±0.05 | 20.90±0.08 |
1）通过氯金酸和柠檬酸钠还原法制得纳米金，然后向其中加入KMnO4和PAH溶液成功制备出飞碟状核壳Au@MnO2纳米粒子。该纳米粒子具有很好的类氧化酶性质，能催化TMB和空气中的氧气发生反应，生成蓝色的oxTMB。而GSH的存在抑制了TMB和氧气的反应，使溶液的蓝色变浅。根据这一性质，成功地设计出了基于Au@MnO2-TMB-O2的比色传感策略的高灵敏检测GSH的方法。
2）Au@MnO2纳米粒子基于的传感系统对GSH出示了出色的检测能力，溶液的吸光度变化与GSH浓度在1 nmol·L−1~50 μmol·L−1的浓度范围内呈良好的线性关系，检测限达到0.79 nmol·L−1。在其他的抗氧化剂作为干扰物的情况下，该传感系统对GSH显示出出色的特异性。重要的是，该方法在定量检测人血清中GSH时表现出良好的性能，在医学诊断中显示出潜在的应用前景。
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